細胞計數(shù)是確定培養(yǎng)中鋪板的細胞濃度、確定細胞活力和評估細胞分離程序結(jié)果的一個組成部分。建議在細胞分離之前進行初始細胞計數(shù);然后可以將該數(shù)字與細胞分離后的細胞計數(shù)進行比較,以計算細胞恢復(fù)率。此外,當(dāng)預(yù)期細胞活力可能會降低時,應(yīng)進行活細胞計數(shù),例如,在處理冷凍保存的細胞或離體操作的細胞時。本文描述了如何使用3%乙酸和亞-CH3藍進行總有核細胞計數(shù),以及如何通過臺盼藍染料排除進行活細胞計數(shù)。
實驗步驟和方法:
I部分:樣品制備
選項1:用3%乙酸和亞-CH3藍對總有核細胞計數(shù)進行細胞稀釋
使用磷酸鹽緩沖鹽水或無血清培養(yǎng)基對充分混合的單細胞懸浮液進行適當(dāng)稀釋。為了準確表示濃度,請使用至少20μL的細胞懸浮液進行稀釋。
示例:制備10倍稀釋液
在微量離心管或96孔板的孔中加入180μL的3%乙酸和亞-CH3藍。混合細胞懸浮液,將20μL添加到含有3%乙酸和亞-CH3藍的試管或孔中。
選項2:通過臺盼藍染料排除對活細胞計數(shù)進行細胞稀釋
確保要計數(shù)的細胞懸浮液*重新懸浮。在細胞沉降之前,將適量的細胞懸液(20-200μL)放入離心管中。加入等體積的0.4%臺盼藍并輕輕混合。將混合物在室溫(15°C–25°C)下孵育5分鐘。
II部分:使用血細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)
通過用70%C2H6O清潔腔室表面來制備血細胞計數(shù)器。擦干。將蓋玻片放在腔室上。
使用20μL移液器重新懸浮細胞混合物,并將10μL的染色細胞放入血細胞計室。
注意:小心不要移動蓋玻片。允許毛細作用將樣品吸入。
將血細胞計數(shù)器放在雙目光學(xué)顯微鏡的載物臺上。將顯微鏡調(diào)整到10倍放大倍率并聚焦在細胞上。
使用手動計數(shù)計數(shù)器,計算血細胞計數(shù)器四個外部正方形中的每一個中的細胞(染色的細胞核)(圖1A),包括位于底部和左側(cè)周邊的細胞,但不包括位于頂部和右手邊(圖1B)。如果在第一部分中使用了3%乙酸和亞-CH3藍,則計算染色的細胞核。如果在第一部分中使用了臺盼藍,則計算未染色的活細胞。
細胞計數(shù)儀
血細胞計數(shù)器圖指示(A)四組紅色和(B)其中一組應(yīng)用于計數(shù)的16個方塊。
注意:適當(dāng)?shù)南♂屜禂?shù)將取決于起始樣本中存在的大致細胞數(shù)量,但應(yīng)使血細胞計數(shù)器中的細胞濃度為每平方(即大或主要正方形)50-100個細胞。如果血細胞計數(shù)器上每個主要正方形的細胞多于或少于大約100個,請使用更大或更小的稀釋因子制備新的稀釋樣品。
血細胞計數(shù)器的九個主要方塊中的每一個都代表0.1mm3的總體積。由于1cm3相當(dāng)于1mL,因此可以使用以下等式確定細胞濃度:
有核細胞總數(shù)/mL=每平方平均細胞數(shù)x稀釋因子x104
示例:如果四個外部方塊中的每一個的細胞計數(shù)在100稀釋因子下分別為21、15、20和17,則平均細胞計數(shù)將為(21+15+20+17)÷4=18.25。
因此,原始懸浮液中細胞的總濃度為:18.25x100x10^4=18,250,000個細胞/mL。
使用人工的細胞計數(shù)方法誤差率較高,為提高細胞計數(shù)的準確度和細胞計數(shù)效率可以使用細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)。博大博聚旗下的細胞計數(shù)儀系列,具有多種規(guī)格供選擇,可以滿足不同的用戶需求。